Zapalenie stawów wywołane kolagenem i TCR u myszy SWR i B10.Q z ekspresją transgenu Ek alfa

Myszy transgeniczne B10.Ek alfa kojarzono z myszami H2-E B10.Q i SWR. Potomstwo F1 i F1 x macierzystego szczepu krzyżówkowego wstecznie testowano pod kątem zapalenia stawów i reaktywności autoimmunologicznej na mysi  kolagen typu  II   (MII ) po immunizacji bydlęcym,  kurzym , jelenim lub  ludzkim kolagenem typu II . Wyniki były skorelowane z typem haplo H-2  (b/q vs q/q) i profilem TCR V beta limfocytów T krwi obwodowej u każdej  myszy .

Hybrydowe potomstwo wyrażało profile TCR inne niż u obu rodziców ze względu na genomowe delecje TCR V beta myszy SWR (V beta a), allel TCR typu dzikiego  myszy C57Bl/10 (B10) (V beta b) i wewnątrzgrasicowy negatywny procesy selekcji wynikające z ekspresji na powierzchni komórki Ek alfa-Aq beta lub Eb beta-Ek alfa, wraz ze zintegrowanymi genami retrowirusowymi Mtv-9 pochodzącymi od myszy B10 i Mtv-7 (Mls-1a) z myszy SWR. Myszy (B10.Ek alfa x SWR)F1 rozwinęły wyższe  miana IgG  anty – M II  Ab, ale znacznie łagodniejsze zapalenie stawów niż myszy (B10.E x B10.Q)F1.

Ekspresja Ek alfa nie zmieniła poziomu  IgG  anty – M II  Ab ani stopnia podatności na  indukowane kolagenem zapalenie stawów (CIA) u potomstwa H-2q/q i H-2b/q (B10.Ek alfa x B10.Q)F1 x B10.Q kojarzenia wskazujące, że limfocyty T reagujące na Mtv-9, TCR V beta 5+ i V beta 11+ nie są krytyczne dla CIA. Wśród myszy krzyżówkowych wstecznych bydlęcych  immunizowanych kolagenem typu  II  (B10.Ek alfa x SWR)F1 x SWR: 1) ciężkość zapalenia stawów jest związana z obecnością V beta b (p < lub = 0,01) i ekspresją Ek alfa (p < lub = 0,05), ale nie z typem haplo MHC  (b/q vs q/q); 2) analiza regresji wykazała istotny związek (R = 0,99) między Miana IgG  anty – M II  Ab i poziom Mtv-7-reaktywnych limfocytów V beta 6+ T, który był wykrywalny we  właściwościach IgG typu IgG , a tym samym przyczynia się do połączenia łagodnego zapalenia stawów z wysokimi  mianami anty – M II  Ab, które charakteryzują myszy dziedzictwa SWR.

Rozpuszczalna endoglina specyficznie wiąże białka morfogenetyczne kości 9 i 10 poprzez swoją domenę sierocą, hamuje tworzenie naczyń krwionośnych i hamuje wzrost guza

  • Endoglina (CD105), białko transbłonowe z nadrodziny transformującego czynnika wzrostu β, odgrywa kluczową rolę w angiogenezie. Mutacje w endoglinie powodują defekt naczyniowy znany jako dziedziczna teleangiektazja krwotoczna (HHT1).
  • Sugerowano, że rozpuszczalna forma endogliny przyczynia się do patogenezy stanu przedrzucawkowego. Aby uzyskać dalszy wgląd w jego funkcję, sklonowaliśmy, wyrażono, oczyszczono i scharakteryzowaliśmy domenę zewnątrzkomórkową (ECD)  mysiej  i ludzkiej endogliny w fuzji z domeną Fc immunoglobuliny.
  • Odkryliśmy, że  mysie  i ludzkie endogliny ECD-Fc wiążą się bezpośrednio, specyficznie i z wysokim powinowactwem do białek morfogenetycznych kości 9 i 10 (BMP9 i BMP10) w powierzchniowym rezonansie plazmonowym (Biacore) i testach komórkowych. Przeprowadziliśmy analizę mapowania funkcji różnych domen endogliny, badając ich wkład w selektywność i aktywność biologiczną białka. Miejsce wiązania BMP9/BMP10 zlokalizowano w sierocej domenie ludzkiej endogliny złożonej z sekwencji aminokwasowej 26-359.
  • Ustaliliśmy, że receptory endogliny i  typu  II  wiążą się z nakładającymi się miejscami na BMP9.  W teście błony kosmówkowo  -omoczniowej kurcząt in vivo  , zarówno mysia , jak i skrócona ludzka endoglina  ECD-Fc znacząco zmniejszały indukowane przez VEGF tworzenie naczyń.
  • Wreszcie, ECD-Fc mysiej endogliny działał jako  czynnik antyangiogenny , który zmniejszał kiełkowanie naczyń krwionośnych w angiogenezie indukowanej przez VEGF/FGF w angioreaktorach in vivo i zmniejszał obciążenie nowotworem w  mysim  modelu nowotworu okrężnicy-26. Razem nasze odkrycia wskazują na ważną rolę rozpuszczalnej endogliny ECD w regulacji angiogenezy i podkreślają skuteczność endogliny-Fc jako potencjalnego  środka terapeutycznego przeciw angiogenezie.

Myszy z nokautem genu Vegfb wykazują zmniejszoną patologię i angiogenezę błony maziowej zarówno w modelach zapalenia stawów wywołanych antygenem, jak i kolagenem.

  1. Określenie roli czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego B (VEGF-B) w 2  mysich  modelach zapalenia stawów, zapalenia stawów wywołanego antygenem (AIA) i zapalenia stawów wywołanego kolagenem (CIA).
  2. W badaniach AIA jednostawowa AIA była indukowana przez priming z metylowaną albuminą surowicy bydlęcej (mBSA) myszy z nokautem genu Vegfb (Vegfb(-/-)) i typu dzikiego (Vegfb(+/+)), a następnie przez dostawowe wstrzyknięcie mBSA lub solanka kontrola 8 dni później. CIA indukowano u myszy Vegfb(-/-) i Vegfb(+/+) przez śródskórne wstrzyknięcie kurczęcego kolagenu typu II w adiuwancie. Zapalenie stawów monitorowano w obu modelach, stosując określone kryteria (kliniczne i histologiczne). Angiogenezę mierzono na podstawie gęstości naczyń maziowych w stawach chorych i kontrolnych.
  3. W badaniach AIA myszy Vegfb(+/+) wykazywały znaczny obrzęk stawu kolanowego i zapalenie błony maziowej 7 dni po dostawowym wstrzyknięciu antygenu.
  4. Zapalenie błony maziowej było związane z angiogenezą, ponieważ gęstość naczyń w błonie maziowej AIA była znacznie wyższa w stawach z zapaleniem stawów niż w kontrolnych stawach tego samego zwierzęcia. Obrzęk stawu kolanowego, zapalenie błony maziowej i związana z zapaleniem gęstość naczyń w stawach z zapaleniem stawów były zmniejszone u myszy Vegfb(-/-) w porównaniu ze stawami z zapaleniem stawów u myszy Vegfb (+/+). Podobnie w CIA, zarówno występowanie choroby, jak i średnie oceny klinicznego nasilenia były znacznie zmniejszone u myszy Vegfb(-/-) w porównaniu z myszami Vegfb(+/+). Średnie oceny nasilenia histologicznego i średnia gęstość naczyń maziówkowych były zmniejszone w chorych stawach myszy Vegfb(-/-) w porównaniu z chorymi stawami myszy Vegfb(+/+).
  5. Zmniejszenie angiogenezy błony maziowej związanej z zapaleniem u myszy Vegfb(-/-) implikuje VEGF-B w patologicznej przebudowie naczyń w zapalnym zapaleniu stawów. VEGF-B może być atrakcyjnym celem w projektowaniu terapii antyangiogennych w reumatoidalnym zapaleniu stawów.

Dowody na rolę  hormonu anty -Mullerowskiego w hamowaniu aktywacji pęcherzyków jajnikowych w  mysich  jajnikach i bydlęcej korze jajnikowej przeszczepionej pod  błoną kosmówkowo – omoczniową kurcząt.

Pierwsza krytyczna zmiana w rozwoju pęcherzyka, aktywacja pierwotnych pęcherzyków w celu opuszczenia puli spoczynkowych pęcherzyków i rozpoczęcia wzrostu, jest słabo poznana, ale wydaje się, że równowaga między czynnikami hamującymi i stymulującymi jest ważna w regulowaniu odpływu pęcherzyków ze spoczynku. basen.

Istnieją dowody, że  hormon anty -Mullerowski (AMH; znany również jako MIS) hamuje aktywację pęcherzyków u myszy, ale nie wiadomo, czy odgrywa podobną rolę u gatunków innych niż gryzonie. Gdy fragmenty kory jajnika bydlęcego, bogate w pierwotne pęcherzyki, są hodowane w pożywce bez surowicy, większość pęcherzyków inicjuje wzrost, ale gdy fragmenty kory są przeszczepiane pod błoną kosmówkowo-omoczniową (CAM)  zarodków kurzych  , aktywacja pęcherzyka nie następuje. Ponieważ embrionalne  gonady piskląt  obu płci wytwarzają i wydzielają wysoki poziom AMH, przetestowano hipotezę, że AMH w  krążeniu piskląt  hamuje aktywację pęcherzyków.

W Eksperymencie 1 całe nowonarodzone  jajniki myszy  przeszczepiono pod CAM (umieszczoną „in ovo”) lub hodowano in vitro przez 8 dni. In vitro (lub po 8 dniach in vivo) pęcherzyki aktywowały się i przechodziły do ​​stadium pierwotnego lub wtórnego, ale aktywacja była tłumiona in ovo.

To hamowanie ulegało odwróceniu, jeśli jajniki usunięto spod CAM i hodowano in vitro. W przeciwieństwie do tego, gdy jajniki myszy z zerowym mutantem receptora AMH  typu  II  przeszczepiono CAM w Eksperymencie 2, aktywacja pęcherzyka zachodziła w podobny sposób do aktywacji in vitro. To odkrycie silnie sugeruje, że AMH jest inhibitorem aktywacji pęcherzyka in ovo. Ponieważ  gonady embrionalne kurcząt  są źródłem krążącego AMH,  pisklęta  poddano gonadektomii w Eksperymencie 3, przed przeszczepieniem kawałków kory jajników bydlęcych pod ich CAM.

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2031 Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2031T Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Rat Anti-Chick Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2041 Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Rat Anti-Chick Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2041T Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Human/Monkey Anti-Chick Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2051 Chondrex 1 kit 622.75 EUR

Human/Monkey Anti-Chick Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2051T Chondrex 1 kit 622.75 EUR

Anti-Chick Type II Collagen Antibody, Clone D8-6

7080 Chondrex 1 mg/ml x 0.1 ml 338.55 EUR

Anti-Chick Type II Collagen Antibody, Clone D8-6, Biotinylated

7081 Chondrex 1 mg/ml x 0.1 ml 338.55 EUR

Mouse Anti-Chick Type I Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

1011T Chondrex 1 kit 103.65 EUR

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG1 Subtype Antibody Assay Kit, (OPD)

20311 Chondrex 1 kit 625.65 EUR

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG1 Subtype Antibody Assay Kit, TMB

20311T Chondrex 1 kit 625.65 EUR

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG2a Subtype Antibody Assay Kit, TMB

20312T Chondrex 1 kit 625.65 EUR

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG2b Subtype Antibody Assay Kit, TMB

20313T Chondrex 1 kit 625.65 EUR

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG3 Subtype Antibody Assay Kit, (OPD)

20314 Chondrex 1 kit 625.65 EUR

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG3 Subtype Antibody Assay Kit, TMB

20314T Chondrex 1 kit 625.65 EUR

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG2c Subtype Antibody Assay Kit, (OPD)

20315 Chondrex 1 kit 625.65 EUR

Mouse Anti-Chick Type II Collagen IgG2c Subtype Antibody Assay Kit, TMB

20315T Chondrex 1 kit 625.65 EUR

Immunization Grade Chick Type II Collagen, 10 mg, lyophilized

20011 Chondrex 10 mg 369 EUR

Rat Anti-Chick Type I Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

1021T Chondrex 1 kit 590.85 EUR

Human Monkey Anti-Chick Type II Collagen IgA Antibody Assay Kit, (OPD)

2061 Chondrex 1 kit 622.75 EUR

Human Monkey Anti-Chick Type II Collagen IgA Antibody Assay Kit, TMB

2061T Chondrex 1 kit 622.75 EUR

Chick CB9 Peptide of Type II Collagen, 0.5 mg, lyophilized

9017 Chondrex 0.5 mg 743.1 EUR

Chick CB10 Peptide of Type II Collagen, 0.5 mg, lyophilized

9018 Chondrex 0.5 mg 743.1 EUR

Chick CB12 Peptide of Type II Collagen, 0.5 mg, lyophilized

9019 Chondrex 0.5 mg 743.1 EUR

Chick CB7 Peptide of Type II Collagen, 0.5 mg, lyophilized

9037 Chondrex 0.5 mg 677.85 EUR

Chick CB8 Peptide of Type II Collagen, 0.5 mg, lyophilized

9063 Chondrex 0.5 mg 628.55 EUR

T-Cell Grade Chick Type II Collagen, 0.5 mg, lyophilized

2021 Chondrex 0.5 mg 296.5 EUR

Human/Monkey Anti-Chick Type I Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

1031T Chondrex 1 kit 628.55 EUR

Mouse Anti-Mouse Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2036 Chondrex 1 kit 738.75 EUR

Mouse Anti-Mouse Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2036T Chondrex 1 kit 738.75 EUR

Anti-Collagen Type II antibody

STJ190047 St John's Laboratory 200 µl 197 EUR

Anti-Collagen Type II Antibody

A00517 BosterBio 100uL 443 EUR

anti- Collagen Type II antibody

FNab01837 FN Test 100µg 505.25 EUR

Anti-Collagen Type II antibody

PAab01837 Lifescience Market 100 ug 355 EUR

ELISA Grade Chick Type II Collagen, 0.5 mg/ml x 1ml

2011 Chondrex 0.5 mg/ml x 1 ml 296.5 EUR

Mouse Anti-Bovine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2032 Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Mouse Anti-Bovine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2032T Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Mouse Anti-Porcine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2033 Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Mouse Anti-Porcine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2033T Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Mouse Anti-Human Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2035 Chondrex 1 kit 660.45 EUR

Mouse Anti-Human Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2035T Chondrex 1 kit 660.45 EUR

Immunization Grade Chick Type II Collagen, 2 mg/ml x 5 ml

20012 Chondrex 2 mg/ml x 5 ml 369 EUR

Human Interferon Type II Signaling Primer Library

HIFN-II Real Time Primers 1 set 548 EUR

Mouse Anti Type II Collagen AutoAntibody ELISA kit

E03A0414-192T BlueGene 192 tests 1270 EUR

Mouse Anti Type II Collagen AutoAntibody ELISA kit

E03A0414-48 BlueGene 1 plate of 48 wells 520 EUR

Mouse Anti Type II Collagen AutoAntibody ELISA kit

E03A0414-96 BlueGene 1 plate of 96 wells 685 EUR

Mouse Anti Type II Collagen Antibody ELISA kit

E03A0429-192T BlueGene 192 tests 1270 EUR

Mouse Anti Type II Collagen Antibody ELISA kit

E03A0429-48 BlueGene 1 plate of 48 wells 520 EUR

Mouse Anti Type II Collagen Antibody ELISA kit

E03A0429-96 BlueGene 1 plate of 96 wells 685 EUR

Collagen Type II protein

E62L002 EnoGene 1mg 1188 EUR

Collagen Type II Fragment

H-1604.0500 Bachem 0.5mg 708 EUR

Collagen Type II Fragment

H-1604.1000 Bachem 1.0mg 1240 EUR

type II collagen fragment

A1096-1 ApexBio 1 mg 108 EUR

type II collagen fragment

A1096-10 ApexBio 10 mg 340 EUR

type II collagen fragment

A1096-25 ApexBio 25 mg 456 EUR

type II collagen fragment

A1096-5 ApexBio 5 mg 224 EUR

Collagen Type II antibody

10R-C135a Fitzgerald 100 ug 553 EUR

Collagen Type II antibody

10R-C135b Fitzgerald 100 ug 797 EUR

Collagen Type II antibody

70R-CR008 Fitzgerald 100 µg 288 EUR

Collagen Type II protein

30R-AC015 Fitzgerald 100 µg 983 EUR

Rat Anti-Bovine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2042 Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Rat Anti-Bovine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2042T Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Rat Anti-Porcine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2043 Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Rat Anti-Porcine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2043T Chondrex 1 kit 605.35 EUR

Rat Anti-Rat Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2044 Chondrex 1 kit 659 EUR

Rat Anti-Rat Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2044T Chondrex 1 kit 659 EUR

Rat Anti-Human Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2045 Chondrex 1 kit 659 EUR

Rat Anti-Human Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2045T Chondrex 1 kit 659 EUR

anti-Collagen II

YF-PA23483 Abfrontier 50 ul 334 EUR

Rat Anti-Type II Collagen Antibody (Anti-CIIAb)

QY-E11659 Qayee Biotechnology 96T 374 EUR

Mouse Collagen Type II ELISA Kit

ELA-E0572m Lifescience Market 96 Tests 865 EUR

Mouse Collagen Type II ELISA kit

E03C0779-192T BlueGene 192 tests 1270 EUR

Mouse Collagen Type II ELISA kit

E03C0779-48 BlueGene 1 plate of 48 wells 520 EUR

Mouse Collagen Type II ELISA kit

E03C0779-96 BlueGene 1 plate of 96 wells 685 EUR

Immunization Grade Chick Type IX Collagen, 5 mg, lyophilized

1071 Chondrex 5 mg 483.55 EUR

Immunization Grade Chick Type XI Collagen, 5 mg, lyophilized

1081 Chondrex 5 mg 405.25 EUR

Mouse Anti-CIIAb(Anti-Type II Collagen Antibody) ELISA Kit

EM0837 FN Test 96T 524.1 EUR

Mouse Cytokine Primer Library II

MCA-II Real Time Primers 1 set 450 EUR

Human/Monkey Anti-Chick Type I Collagen IgA Antibody Assay Kit, (OPD)

1041 Chondrex 1 kit 628.55 EUR

Human/Monkey Anti-Chick Type I Collagen IgA Antibody Assay Kit, TMB

1041T Chondrex 1 kit 628.55 EUR

Human/Monkey Anti-Bovine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2052 Chondrex 1 kit 622.75 EUR

Human/Monkey Anti-Bovine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2052T Chondrex 1 kit 622.75 EUR

Human/Monkey Anti-Porcine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2053 Chondrex 1 kit 622.75 EUR

Human/Monkey Anti-Porcine Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2053T Chondrex 1 kit 622.75 EUR

Human/Monkey Anti-Human Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, (OPD)

2055 Chondrex 1 kit 666.25 EUR

Human/Monkey Anti-Human Type II Collagen IgG Antibody Assay Kit, TMB

2055T Chondrex 1 kit 666.25 EUR

Native Chicken Collagen Type II

NATE-1165 Creative Enzymes 1kg 378 EUR

Collagen Type II (COL2) Antibody

20-abx101463 Abbexa
  • 411.00 EUR
  • 133.00 EUR
  • 1135.00 EUR
  • 551.00 EUR
  • 314.00 EUR
  • 100 ug
  • 10 ug
  • 1 mg
  • 200 ug
  • 50 ug

Collagen Type II (COL2) Antibody

20-abx101464 Abbexa
  • 425.00 EUR
  • 133.00 EUR
  • 1177.00 EUR
  • 578.00 EUR
  • 328.00 EUR
  • 100 ug
  • 10 ug
  • 1 mg
  • 200 ug
  • 50 ug

Collagen Type II (COL2) Antibody

20-abx101465 Abbexa
  • 425.00 EUR
  • 133.00 EUR
  • 1177.00 EUR
  • 578.00 EUR
  • 328.00 EUR
  • 100 ug
  • 10 ug
  • 1 mg
  • 200 ug
  • 50 ug

Collagen Type II (COL2) Antibody

20-abx101466 Abbexa
  • 425.00 EUR
  • 133.00 EUR
  • 1177.00 EUR
  • 578.00 EUR
  • 328.00 EUR
  • 100 ug
  • 10 ug
  • 1 mg
  • 200 ug
  • 50 ug

Collagen Type II (COL2) Antibody

20-abx101467 Abbexa
  • 439.00 EUR
  • 133.00 EUR
  • 1233.00 EUR
  • 592.00 EUR
  • 328.00 EUR
  • 100 ug
  • 10 ug
  • 1 mg
  • 200 ug
  • 50 ug

Collagen Type II (COL2) Antibody

abx149309-100ug Abbexa 100 ug 425 EUR

Collagen Type II (COL2) Antibody

20-abx013043 Abbexa
  • 314.00 EUR
  • 98.00 EUR
  • 398.00 EUR
  • 495.00 EUR
  • 100 ug
  • 10 ug
  • 200 ug
  • 300 µg

Collagen Type II (COL2) Antibody

abx022742-05ml Abbexa 0.5 ml 1156 EUR

Collagen Type II (COL2) Antibody

abx022747-05ml Abbexa 0.5 ml 1156 EUR

Collagen Type II (COL2) Antibody

20-abx175938 Abbexa
  • 1107.00 EUR
  • 537.00 EUR
  • 1 mg
  • 200 ug

Collagen Type II (COL2) Antibody

abx231837-100ug Abbexa 100 ug 481 EUR

Bovine Collagen Type II ELISA

QY-E60040 Qayee Biotechnology 96T 426 EUR

Mouse DNA Repair Primer Library II

MDRL-II Real Time Primers 1 set 645 EUR

Pierwotne pęcherzyki bydlęce aktywowały się u  kurcząt po gonadektomii , podobnie jak w przypadku myszy pozbawionych   receptora AMH typu  II . Podsumowując, doświadczenia te dostarczają mocnych dowodów na to, że AMH jest inhibitorem  aktywacji pęcherzyków myszy  obecnym w krążeniu embrionalnych  kurcząt  i dostarczają pośredniego, a zatem bardziej niepewnego, dowodu na to, że AMH jest inhibitorem aktywacji pęcherzyków bydlęcych.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.